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DNAへの逆転写 ※■ Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line 「MDPI（受領日 2022 年 1 月 18 日/改訂 2022 年 2 月 19 日/承認済み 2022 年 2 月 23 日/公開日 2022 年 2 月 25 日）」より Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 の in vitro ヒト肝細胞株における細胞内逆転写 以下にGoogle機械翻訳 設定記事の再版を注文する オープンアクセス記事 Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 の in vitro ヒト肝細胞株における細胞内逆転写 にマルクス・アルデン1ORCID、フランシスコ・オロフソン・ファリャ1、ヤン・ダオウェイ1、モハマド・バルグート1、チェン・ルアン1、マグナス・ラスムッセン2とヤン・デ・マリニス1,*ORCID 1 臨床科学科、ルンド大学、20502 マルメ、スウェーデン 2 感染症医学、臨床科学科、ルンド大学、22362 ルンド、スウェーデン * 通信の宛先となる著者。 現在。モルを発行します。生物。 2022、44 (3)、1115-1126。https //doi.org/10.3390/cimb44030073 受領日 2022 年 1 月 18 日/改訂 2022 年 2 月 19 日/承認済み 2022 年 2 月 23 日/公開日 2022 年 2 月 25 日 (この記事はトピック 肝疾患に関する臨床、トランスレーショナルおよび基礎研究に属します) 設定記事の再版を注文する オープンアクセス記事 Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 の in vitro ヒト肝細胞株における細胞内逆転写 にマルクス・アルデン1ORCID、フランシスコ・オロフソン・ファリャ1、ヤン・ダオウェイ1、モハマド・バルグート1、チェン・ルアン1、マグナス・ラスムッセン2とヤン・デ・マリニス1,*ORCID 1 臨床科学科、ルンド大学、20502 マルメ、スウェーデン 2 感染症医学、臨床科学科、ルンド大学、22362 ルンド、スウェーデン * 通信の宛先となる著者。 現在。モルを発行します。生物。 2022、44 (3)、1115-1126。https //doi.org/10.3390/cimb44030073 受領日 2022 年 1 月 18 日/改訂 2022 年 2 月 19 日/承認済み 2022 年 2 月 23 日/公開日 2022 年 2 月 25 日 (この記事はトピック 肝疾患に関する臨床、トランスレーショナルおよび基礎研究に属します) ダウンロード フィギュアを見る バージョン 注意事項 概要 ファイザーと BioNTech によって開発された COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 の前臨床研究では、BNT162b2 注射を受けた動物で可逆的な肝臓への影響が示されました。さらに、最近の研究では、SARS-CoV-2 RNA が逆転写され、ヒト細胞のゲノムに組み込まれる可能性があることが示されました。この研究では、in vitro でヒト肝細胞株 Huh7 に対する BNT162b2 の効果を調査しました。Huh7 細胞を BNT162b2 に曝露し、細胞から抽出した RNA に対して定量的 PCR を実施しました。Huh7細胞で高レベルのBNT162b2が検出され、内因性逆転写酵素である長い散在核要素-1（LINE-1）の遺伝子発現の変化が検出されました。BNT162b2 で処理した Huh7 細胞上の LINE-1 オープン リーディング フレーム 1 RNA 結合タンパク質 (ORFp1) に結合する抗体を使用した免疫組織化学は、LINE-1 の核分布の増加を示しました。BNT162b2 に曝露された Huh7 細胞のゲノム DNA に対する PCR により、BNT162b2 に固有の DNA 配列が増幅されました。私たちの結果は、BNT162b2がヒト肝細胞株Huh7に急速に取り込まれ、LINE-1の発現と分布が変化することを示しています。また、BNT162b2 mRNA は、BNT162b2 曝露時に 6 時間という速さで細胞内 DNA に逆転写されることも示しています。 キーワード COVID-19 mRNAワクチン; BNT162b2 ; 肝臓; 逆転写; LINE-1 ; Huh7 1.はじめに 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) によって引き起こされるコロナウイルス病 2019 (COVID-19) は、2020 年 3 月 11 日に世界保健機関 (WHO) によって世界的なパンデミックとして発表され、壊滅的な健康危機として浮上しました。 . 2022 年 2 月の時点で、COVID-19 により、世界中で 4 億 3000 万件を超える感染症例が報告され、590 万人が死亡しています [ 1 ]。COVID-19 に関連する罹患率と死亡率を下げるには、効果的で安全なワクチンが緊急に必要です。 COVID-19 のいくつかのワクチンが開発されており、特に mRNA ワクチン (Pfizer-BioNTech および Moderna による)、複製欠損組換えアデノウイルスベクターワクチン (Janssen-Johnson および Johnson、Astra-Zeneca、Sputnik-V、および CanSino による) に焦点を当てています。 )、および不活化ワクチン (Sinopharm、Bharat Biotech、および Sinovac による)。mRNA ワクチンには、免疫原の設計と製造が柔軟かつ効率的であるという利点があり、現在、多数のワクチン候補が開発および適用のさまざまな段階にあります。具体的には、ファイザーと BioNTech によって開発された COVID-19 mRNAワクチンBNT162b2は、成功した臨床試験で評価されています [ 2、3、4] 世界中のさまざまな地域で全国的な COVID-19 ワクチン接種キャンペーンで実施されています[ 5、6、7、8 ]。 BNT162b2 は、脂質ナノ粒子 (LNP) でカプセル化されたヌクレオシド修飾 RNA ワクチン (modRNA) であり、SARS-CoV-2 スパイク (S) タンパク質の全長をコードし、抗原的に最適な融合前立体構造を確保するために 2 つのプロリン変異によって修飾されています、無傷のウイルスを模倣して、ウイルス中和抗体を誘発します [ 3 ]。無作為化臨床試験と一致して、BNT162b2 は、現実世界の設定で COVID-19 関連の幅広い結果において高い効率を示しました [ 5]。それにもかかわらず、ワクチンの長期的な安全性と有効性の監視など、多くの課題が残っています。これは、さらなる評価と調査を保証します。BNT162b2 の安全性プロファイルは、現在、短期の臨床研究からのみ入手できます。心膜炎、不整脈、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、頭蓋内出血、血小板減少症など、BNT162b2 のあまり一般的ではない副作用が報告されています[ 4、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20]。他のタイプのワクチンで観察された副作用を報告する研究もあります [ 21 , 22 , 23 , 24 ]。ワクチン関連の副作用の根底にあるメカニズムをよりよく理解するには、臨床調査と細胞および分子分析が必要です。 最近の研究では、SARS-CoV-2 RNA が逆転写され、ヒト細胞のゲノムに組み込まれることが示されました [ 25 ]。これは、部分的な SARS-CoV-2 RNA をコードする BNT162b2 でも発生する可能性があるかどうかという問題を引き起こします。ファイザーが欧州医薬品庁 (EMA) に提供した薬物動態データでは、BNT162b2 の体内分布が、放射性標識 LNP とルシフェラーゼ modRNA を筋肉内注射することによってマウスとラットで研究されました。放射能は最初の時点 (0.25 時間) からほとんどの組織で検出され、その結果、注射部位と肝臓が主要な分布部位であり、投与後 8 ～ 48 時間で最大濃度が観察されたことが示されました [ 26]。さらに、BNT162b2 注射を受けた動物では、肝臓の肥大、空胞化、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ (γGT) レベルの上昇、アスパラギン酸トランスアミナーゼ (AST) およびアルカリホスファターゼ (ALP) レベルの上昇など、可逆的な肝臓への影響が観察された [26 ]。LNP送達システムによって誘発される一過性の肝臓への影響が以前に報告されている [ 27、28、29、30 ] にもかかわらず、 modRNAのみを含まない空の LNP だけでは重大な肝障害を引き起こさないことも示されている [27 ] 。]。したがって、この研究では、 in vitro でヒト肝細胞株に対するBNT162b2の効果を調べ、BNT162b2が内因性メカニズムを介してDNAに逆転写できるかどうかを調査することを目的としています。 2。材料と方法 2.1. 細胞培養 Huh7 細胞 (JCRB セルバンク、大阪、日本) を、 10% ( v / v ) ウシ胎児血清 (Sigma-Aldrich、F7524 ) を添加した DMEM 培地 (HyClone、HYCLSH30243.01) を用いて、 37 °C、5% CO 2で培養しました。 -500ML、米国マサチューセッツ州バーリントン) および 1% ( v / v ) ペニシリン-ストレプトマイシン (HyClone、SV30010、米国ユタ州ローガン)。BNT162b2 処理では、Huh7 細胞を 24 ウェル プレートに 200,000 細胞/ウェルの密度で播種しました。BNT162b2 mRNA ワクチン (Pfizer BioNTech, New York, NY, USA) を無菌の 0.9% 塩化ナトリウム注射液 (USP) で最終濃度 100 μg/mL に希釈し、製造元のガイドライン [ 31]。次いで、ＢＮＴ１６２ｂ２懸濁液を細胞培養培地に添加して、最終濃度０．５、１．０、または２．０μｇ／ｍＬに到達させた。Huh7 細胞を BNT162b2 の有無にかかわらず、6、24、および 48 時間インキュベートしました。細胞をPBSで完全に洗浄し、トリプシン処理によって回収し、さらに使用するまで-80°Cで保存しました。 2.2. リアルタイム RT-QPCR 製造元のプロトコルに従って、RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen、74134、ヒルデン、ドイツ) を使用して、細胞から RNA を抽出しました。RT-PCRは、RevertAid First Strand cDNA合成キット（Thermo Fisher Scientific、K1622、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用して、製造元のプロトコルに従って実行されました。Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific、K0222、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用して、BNT162b2、 LINE-1、およびハウスキーピング遺伝子ACTBおよびGAPDHのプライマーを使用して、リアルタイム qPCR を実行しました（ 表1 ）。 2.3. 免疫蛍光染色と共焦点イメージング Huh7 細胞を、BNT162b2 (0.5、1 または 2 μg/mL) の有無にかかわらず、40,000 細胞/ウェルの密度で 8 チャンバー スライド (LAB-TEK、154534、カリフォルニア州サンタクルーズ) で 6 時間培養しました。一次抗体抗LINE-1 ORF1pマウスモノクローナル抗体（Merck、3574308、Kenilworth、NJ、USA）、二次抗体Cy3 Donkey抗マウス（Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA、USA）、およびHoechst（Lifeテクノロジー、34850、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)、Thermo Fisher (ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) のプロトコルに従います。Zeiss LSM 800 と 63X 油浸対物レンズを使用して条件ごとに 2 つの画像を撮影し、ImageJ 1.53c によって画像ごとに 15 細胞の個々の全細胞領域と核領域の染色強度を定量化しました。サイトゾルのLINE-1染色強度は、細胞全体の強度から核の強度を差し引くことによって計算されました。細胞のすべての画像には、偏りを防ぐために乱数が割り当てられました。核 (Hoechst 染色によって決定) と全細胞 (LINE-1 蛍光の境界によって決定) をマークするために、フリーハンド選択ツールを使用しました。次に、これらの領域を測定し、平均強度を使用してグループを比較しました。 2.4. ゲノムDNA精製、PCR増幅、アガロースゲル精製、サンガーシーケンシング ゲノム DNA は、PBND バッファー (10 mM Tris-HCl pH 8.3、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2、0.45% NP-40、0.45% Tween-20) を使用して、以前に記載されたプロトコルに従って細胞ペレットから抽出しました [32 ]。DNA 調製物から残留 RNA を除去するために、RNase (100 µg/mL、Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を DNA 調製物に加え、37 °C で 3 時間、続いて 95 °C で 5 分間インキュベートしました。次いで、ＢＮＴ１６２ｂ２を標的とするプライマー（配列を表１に示す）を用いて、以下のプログラムでＰＣＲを実施した：９５℃で５分間、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で３５サイクル1分間; 最後に、72 °C で 5 分間、12 °C で 5 分間。PCR 産物は 1.4% ( w / v) アガロースゲル。予想されるサイズ（444 bps）のアンプリコンに対応するバンドを切り取り、製造元の指示に従って、QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen、28104、ヒルデン、ドイツ）を使用してDNAを抽出しました。DNAアンプリコンの配列は、サンガー配列決定（Eurofins Genomics、Ebersberg、Germany）によって検証されました。 統計 スチューデントの両側ｔ検定およびＡＮＯＶＡを用いて統計的比較を行った。データは、平均 ± SEM または ± SD として表されます。p 0.05の差は有意と見なされます。 2.5。倫理声明 Huh7 細胞株は、日本の研究生物資源コレクション (JCRB) セルバンクから入手しました。 3. 結果 3.1. BNT162b2 は高効率でヒト肝細胞株 Huh7 細胞に入ります BNT162b2 がヒト肝細胞に侵入するかどうかを判断するために、ヒト肝細胞株 Huh7 を BNT162b2 に曝露しました。Huh7 細胞における LNP 送達の取り込み動態に関する以前の研究では、LNP の最大の生物学的効果は 4 ～ 7 時間の間に観察されました [ 33 ]。したがって、私たちの研究では、Huh7 細胞は BNT162b2 の濃度を増加させて (0.5、1.0、および 2.0 μg/mL)、6、24、および 48 時間培養しました。RNA を細胞から抽出し、図 1に示すように、BNT162b2 配列をターゲットとするプライマーを使用して、リアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) を実行しました。BNT162b2 の全配列は公開されている [ 34] であり、2 ヌクレオチドのキャップが含まれています。ヒトα-グロビン遺伝子の5'-UTRを組み込んだ5'-非翻訳領域（UTR）。2 つのプロリン変異を持つ SARS-CoV-2 S タンパク質の全長。ヒトミトコンドリア12S rRNA（mtRNR1）セグメントと2つのC→U変異を持つヒトAES / TLE5遺伝子セグメントを組み込んだ3'-UTR。ポリ（A）テール。BNT162b2のSタンパク質配列の詳細な分析により、ヒトゲノム配列と100％同一の124の配列と、19〜26 ntで1つのヌクレオチド（nt）ミスマッチのみを含む3つの配列が明らかになりました（表S1、補足資料を参照））。BNT162b2 RNAレベルを検出するために、SARS-CoV-2 Sタンパク質領域に位置するフォワードプライマーと3'-UTRにリバースプライマーを持つプライマーを設計しました。これにより、プライマーがヒトゲノム領域に非特異的に結合することなく、BNT162b2に固有のPCRアンプリコンを検出できます。 . RT-qPCRの結果は、BNT162b2で処理したHuh7細胞が、6、24、および48時間でハウスキーピング遺伝子と比較して高レベルのBNT162b2 mRNAを有することを示しました（図2、非常に高いレベルのため、log 2 -ΔΔCTで表示）。3 つの BNT162b2 濃度は、1.0 と 2.0 μg/mL の間の有意差が 48 時間で観察されたことを除いて、異なる時点で同様の細胞内 BNT162b2 mRNA レベルをもたらしました。BNT162b2 mRNA レベルは、6 時間と比較して 24 時間で大幅に減少しましたが、48 時間で再び増加しました。 3.2. ヒト内因性逆転写酵素の長い散在核要素-1（LINE-1）に対するBNT162b2の効果 ここでは、 LINE-1遺伝子発現 に対する BNT162b2 の効果を調べました。RT-qPCR は、LINE-1をターゲットとするプライマーを使用して、BNT162b2 (0、0.5、1.0、および 2.0 μg/mL) で 6、24、および 48 時間処理された Huh7 細胞から精製された RNA に対して実行されました。2.0 μg/mL BNT162b2 では、コントロールと比較してLINE-1発現の大幅な増加が6 時間で観察されましたが、BNT162b2 濃度が低いほど、すべての時点でLINE-1発現が減少しました (図 3 )。 次に、LINE-1タンパク質レベルに対するBNT162b2の効果を調べました。全長 LINE-1 は、5' 非翻訳領域 (UTR)、2 つのオープンリーディングフレーム (ORF)、ORF1 および ORF2、および 3'UTR で構成され、ORF1 はシャペロン活性を持つ RNA 結合タンパク質です。LINE-1 のレトロトランスポジション活性は、核への ORF1 トランスロケーションに関与することが実証されています [ 35 ]。BNT162b2 (0.5、1.0、および 2.0 μg/mL) の有無にかかわらず 6 時間処理した Huh7 細胞を固定し、LINE-1 ORF1p に結合する抗体、および細胞核を可視化するための DNA 特異的プローブ Hoechst で染色しました (図 4 a )。免疫蛍光染色強度の定量化により、BNT162b2 は、試験したすべての濃度で全細胞領域と核の両方で LINE-1 ORF1p タンパク質レベルを増加させることが示されました (図 4 b–d)。 3.3. Huh7 細胞における逆転写 BNT162b2 DNA の検出 以前の研究では、LINE-1 タンパク質の核への侵入が逆転位と関連していることが示されている [ 35 ]。上記の免疫蛍光染色実験では、BNT162b2 の最低濃度 (0.5 μg/mL) で既に核内の LINE-1 レベルの増加が観察されました。LINE-1 が上昇したときに BNT162b2 が DNA に逆転写されるかどうかを調べるために、0.5 μg/mL の BNT162b2 で 6、24、および 48 時間処理した Huh7 細胞からゲノム DNA を精製しました。図１に示すように、精製したＤＮＡをＲＮａｓｅで処理してＲＮＡを除去し、ＢＮＴ１６２ｂ２を標的とするプライマーを使用してＰＣＲを行った。次に、増幅された DNA フラグメントを電気泳動で可視化し、ゲル精製しました (図 5）。BNT162b2 DNA アンプリコンは、3 つの時点 (6、24、および 48 時間) すべてで検出されました。サンガー配列決定により、DNAアンプリコンがプライマーに隣接するBNT162b2配列と同一であることが確認されました（表2）。DNA アンプリコンが BNT162b2 RNA ではなく DNA に由来することを確認するために、RNase 処理の有無にかかわらず、0.5 μg/mL BNT162b2 で 6 時間処理した Huh7 細胞から精製した RNA に対して PCR を実行しました (図 5 の Ctrl 5 および 6 )。 、PCR に供した RNA サンプルではアンプリコンは検出されませんでした。 4。討議 この研究では、COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 が in vitro でヒト肝細胞株 Huh7 に侵入できるという証拠を提示します。BNT162b2 mRNA は、BNT162b2 曝露後 6 時間という速さで細胞内で DNA に逆転写されます。逆転写の可能なメカニズムは、内因性逆転写酵素 LINE-1 によるものであり、LINE-1 の核タンパク質分布は BNT162b2 によって上昇します。 肝細胞における LNP の細胞内蓄積は、in vivo で実証されている [ 36 ]。BNT162b2 に関する前臨床研究では、BNT162b2 がヒト細胞株 HEK293T 細胞に入り、BNT162b2 抗原の強力な発現をもたらすことが示されました [ 37 ]。したがって、この研究では、最初にヒト肝細胞株Huh7細胞へのBNT162b2の侵入を調査しました。この研究で使用された BNT162b2 濃度の選択は、説明を保証します。BNT162b2 は 3 週間間隔で 2 回連続して投与され、各用量には 0.3 mL の容量に 30 μg の BNT162b2 が含まれており、注射部位の局所濃度は最高で 100 μg/mL になります [31] 。]。同様の LNP 送達システムを使用した H10N8 および H7N9 インフルエンザ ウイルスに対する mRNA ワクチンに関する以前の研究では、mRNA ワクチンが肝臓、脾臓、心臓、腎臓、肺、脳などのいくつかの臓器にかなり非特異的に分布し、肝臓は、筋肉内注射部位の約 100 倍低い [ 38 ]。ファイザーによって EMA に提供された BNT162b2 に関する評価レポートでは、ラットの薬物動態分布研究により、総用量の比較的大きな割合 (最大 18%) が肝臓に分布することが示されました [ 26]。したがって、肝細胞の実験では、0.5、1、および 2 μg/mL のワクチンを使用することを選択しました。ただし、BNT162b2 のより広い範囲の低濃度および高濃度の効果も、将来の研究で検証する必要があります。 現在の研究では、in vitro 調査のためにヒト肝細胞株を採用しました。肝細胞がワクチン由来のSARS-CoV-2スパイクタンパク質も提示するかどうかは調査する価値があります。これにより、肝細胞が以前にプライミングされたスパイクタンパク質反応性細胞傷害性T細胞の標的になる可能性があります. BNT162b2 ワクチン接種後に自己免疫性肝炎 [ 39 ]を発症した個人の症例報告があります。肝機能に対するBNT162b2の潜在的な影響をよりよく理解するために、将来の研究にはin vivoモデルが望まれます。 BNT162b2 の毒性報告では、遺伝毒性や発がん性の研究は提供されていません [ 26 ]。私たちの研究は、BNT162b2が肝細胞株Huh7のDNAに逆転写される可能性があることを示しており、これは、BNT162b2由来のDNAが宿主ゲノムに組み込まれ、ゲノムDNAの完全性に影響を与え、遺伝毒性を潜在的に媒介する可能性があるかどうかという懸念を引き起こす可能性があります副作用。この段階では、BNT162b2 から逆転写された DNA が細胞ゲノムに組み込まれているかどうかはわかりません。BNT162b2にさらされた細胞の全ゲノム配列決定や、BNT162b2ワクチン接種を受けたヒト被験者の組織など、BNT162b2がゲノムの完全性に及ぼす影響を実証するには、さらなる研究が必要です。 ヒト自律型レトロトランスポゾン LINE-1 は、細胞内因性逆転写酵素であり、ヒトに残っている唯一のアクティブなトランスポゾンであり、それ 自体および他の非自律的要素をレトロトランスポーズすることができ [40、41]、ヒトゲノムの約 17% が LINE-1 配列で構成されています。 [ 42 ]。非自律型Alu要素、短い散在型ヌクレオチド要素 (SINE)、可変数タンデムリピート (VNTR)、および細胞の mRNA で処理された偽遺伝子は、トランスで働く LINE-1 レトロトランスポジションタンパク質によってレトロトランスポーズされる[ 43、44]。最近の研究では、内因性 LINE-1 が、感染したヒト細胞のゲノムにおける SARS-CoV-2 配列の逆転写と統合を媒介することが示されました [25 ]。さらに、内因性 LINE-1 の発現は、SARS-CoV-2 感染を含むウイルス感染時にしばしば増加します[ 45、46、47 ]。以前の研究は、LINE-1 レトロトランスポジション活性が RNA 代謝 [ 48 , 49 ]、DNA 損傷応答 [ 50 ]、およびオートファジー [ 51 ] によって調節されることを示しました。LINE-1 の効率的なレトロトランスポジションは、多くの場合、有糸分裂中の細胞周期および核膜の崩壊と関連している [ 52、53]、およびLINE-1の核への侵入を促進する外因性レトロウイルス[ 54、55 ] 。私たちの研究では、テストしたすべての濃度（0.5、1、および2μg/ mL）でBNT162b2による核内の免疫組織化学によって決定されるLINE-1 ORF1p分布の増加が観察されましたが、LINE-1は上昇しました遺伝子発現は、BNT162b2 の最高濃度 (2 μg/mL) で検出されました。遺伝子転写は、クロマチン修飾、転写因子調節、および RNA 分解速度によって調節されることは注目に値しますが、タンパク質の翻訳調節には、開始コドンでのリボソーム動員、ペプチド伸長の調節、タンパク質合成の終結、またはリボソーム生合成が含まれます。 . これらの 2 つのプロセスは、異なるメカニズムによって制御されているため、外部の課題に対応して常に同じ変化パターンを示すとは限りません。BNT162b2 に応答した LINE-1 活動の正確な調節は、さらなる研究に値します。 この研究で使用した細胞モデルは癌細胞株であり、分裂していない体細胞とは異なるアクティブな DNA 複製があります。また、Huh7 細胞は、RNA 代謝に関与するアップレギュレートされたタンパク質を含む、有意に異なる遺伝子およびタンパク質の発現を示すことも示されています [ 56 ]。ただし、細胞増殖は、骨髄や上皮の基底層などのいくつかのヒト組織でも胚形成中に活発であるため、そのような条件下でのゲノムの完全性に対するBNT162b2の影響を調べる必要があります。さらに、LINE-1 の効果的な逆転移は、ヒトニューロンなどの非分裂細胞および最終分化細胞でも報告されています [ 57 , 58 ]。 ファイザーの EMA 評価レポートでは、BNT162b2 が脾臓 ( 1.1%)、副腎 ( 0.1%)、および卵巣と精巣 ( 0.1%) の低い測定可能な放射能に分布することも示されました [26 ]。さらに、BNT162b2 の胎盤移行に関するデータは、ファイザーの EMA 評価レポートから入手できません。私たちの結果は、BNT162b2 mRNA が局所注射部位濃度の 0.5% に相当する濃度 (0.5 μg/mL) で Huh7 細胞に容易に入り、LINE-1 遺伝子およびタンパク質発現の変化を誘発し、6 時間以内に BNT162b2 の逆転写を引き起こすことを示しました。検出できます。したがって、in vitro および in vivo の両方で、他の細胞型および組織に対する BNT162b2 の効果をさらに調査することが重要です。 5。結論 私たちの研究は、ヒト肝細胞株に対する COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 の効果に関する最初の in vitro 研究です。BNT162b2 の細胞への高速侵入と、それに続く BNT162b2 mRNA の DNA への細胞内逆転写に関する証拠を提示します。 補足資料 次のサポート情報は、https //www.mdpi.com/article/10.3390/cimb44030073/s1 からダウンロードできます。 著者の貢献 MA、FOF、DY、MB、CL は in vitro 実験を行いました。MA と FOF は、データ分析を実行しました。MR と YDM は、研究の実施に貢献し、研究を設計し、監督しました。YDM は、すべての著者からの情報をもとに論文を書きました。すべての著者は、原稿の公開版を読み、同意しました。 資金調達 この研究は、スウェーデン研究評議会、戦略的研究エリア Exodiab、Dnr 2009-1039、スウェーデン政府臨床研究基金 (ALF)、およびスコーネ大学病院の財団によって支援されました。 治験審査委員会の声明 適用できない。 インフォームド コンセント ステートメント 適用できない。 データの可用性に関する声明 この調査結果を裏付けるすべてのデータは、記事およびサポート情報内で入手できます。 謝辞 著者は、Sven Haidl、Maria Josephson、Enming Zhang、Jia-Yi Li、Caroline Haikal、および Pradeep Bompada のこの研究への支援に感謝します。 利益相反 著者は利益相反を宣言していません。 参考文献 ※mono....以下略
https://w.atwiki.jp/nicoratch/pages/1204.html
概要 2つのUSBポートを搭載しMIDIコントローラーとしても使用可能なCDJ。多分OEM品。 スペック表 Player Reliable Anti-Shock playback with buffer memory Disc Slot-in loading mechanism Link up two players Automatic and manual tap beat counter Sleep function for reducing power consumption Media Types Support for CD / MP3 playback with text display 2 USB sockets for external USB device support All control elements are MIDI compatible A, B deck switchable MIDI setup ID3 TAG and CD text support Playback Instant start via 1 bit technology (8 fold) Next Track pre-selection track function Instant playback from cue point Fader start to control playback on fader move Relay play function Single and Continuous play modes Vinyl emulation with adjustable Start /Brake Speed Reverse play mode for special effects Cue Play function can back to cue and play instantly Data Search Track and folder searching system Search/Scan via large jog wheel Frame search for precisely searching VOXOA TUNEBOX software for fast searching massive USB device Onboard file and folder browsing Cues/Loops Innovate A.C.P. Active Cue Point indicator system Auto cue function cues track to start of music Seamless loop function / reloop function Loop out point real-time adjustment 4 independent hot cues/loops banks with real-time adjustment Auto Loop function with 11 selectable bar lengths Every track can save 4 hot cues/loops up to 2000 for CD and unlimited for USB drive 4 independent 5 second samples with pitch and volume adjustable Pitch Control Adjustable pitch range ±6%, ±10%, ±16% and ±100% High quality 100 mm long pitch fader Micro pitch with a resolution up to 0.02% Pitch bend up to ± 100% Key Lock allow a track’s tempo to be changed without affecting the original key of the track Jog Wheel Touch sensitive jog wheel for scratching Jog wheel lighting ring provides instantaneous visual feedback Jog Wheel illumination with 9 different modes Multifunctional jog wheel for frame search, pitch bend, sample adjustment and effects adjustment 3 modes for jog wheel Normal CDJ, Scratch, Cue Scratch A Cue Scratch mode – touch wheel return-to-cue function Effects 3 superb beat synchronized digital effects Build-in Effects Echo, Flanger, Filter Effect parameters Time and Depth adjustable via Jog Wheel Beat select/bank button Display Especially bright dot-matrix VFD display for all functions Large extra bright display for all important functions Display playing address Elapsed/remain time display Displays text for ID3 tags and folder names for easy navigation Text display for navigating folders on MP3 CDs and USB flash drives Output Digital S/PDIF output Headphones output with volume control Analog RCA outputs ProductModel P70 , Digital media player PowerAC100-240V, 50/60Hz, 19W Size218mm (W) X 296mm (D) X 103.5mm (H) Weight2.5 kg Sound Characteristics (1) Output Level CD Typical 2V +/-0.5dB, Limit 2V +/-1dB @1KHz, 0dB USB1,2 Typical 1.85V +/-0.5dB, Limit 1.85V +/-1dB (2) Channel Balance Typical within 0.2dB, Limit within 1dB, @ 1KHz, 0dB (3) Frequency Response CD Typical 17-20KHz +/-0.4dB, Limit 17-20KHz +/-1dB @0dB OUTPUT USB1,2 Typical 17-16KHz +/-0.2dB, Limit 17-16KHz +/-1dB (4) DE-EMPHASIS CD Typical -20dB +/-0.2dB, Limit -20dB +/-1dB 16KHz,-20dB (5) CHANNEL SEPARATION CD, USB1,2 Typical 91dB 85dB, Limit 1KHz, 0dB (6) THD+N CD Typical 0.006%, Limit 0.01% @1KHz, 0dB USB1,2 Typical 0.007%, Limit 0.01% @ 1KHz, 0dB (7) S/N Ratio Typical 126dB, Limit 90dB @ 1KHz, 0dB (8) PHONES Output Level CD Typical 0.35V +/-0.5dB 0.35V +/-1dB @1KHz, -20dB (9) DIGITAL Output Level Typical 0.5 +/-0.03V P-P, Limit 0.5 +/-0.1V P-P @ 75 ohm load (USB Test format MP3, 128kbps; load=100K ohm) CD Search Time (1) Short Access Time 2sec 4sec PLAY NEXT TRACK (2) Long Access Time 4sec 6sec TRACK 1 TO 20,20 TO 1 (3) INTERRUPTION 1mm 0.7mm TCD-725 (4) BLACK DOT 1mm 0.6mm TCD-725 (5) FINGER PRINTS 75um 65um TCD-725 (6) ECCENTRICITY 140um 140um TCD-712 W/O TRACK JUMP (7) VERTICAL DEVIATION 1mm 0.5mm TCD-731R (8) SCRATCH 2mm 1.2mm TCD-721 W/O TRACK JUMP MP3 Format Disc Format - Applicable file extensions mp3 . MP3 . mP3 . Mp3 - ISO9660 max. 63 characters - Joliet max. 63 characters - CD-ROM sector format mode-1 only - Max number of folders 255 - Max number of files 999 total (max 255 files in each folder) USB Format - File System FAT 12/16/32 - Applicable file extensions mp3. MP3. mP3. Mp3 - Max number of folders 255 - Max number of files 999 total MP3 Format - MPEG 1 Layer 3 standard (ISO/IEC 11172-3) (sampling rates of 32, 44.1, 48kHz) 32/40/48/56/80/96/112/128/160/192/224/256/320 kbps Xing/VBRI VBR - MPEG 2 Layer 3 standard (ISO/IEC 13818-3) (sampling rates of 16, 22.05 and 24 kHz) 32/40/48/56/64/80/96/112/144/160 Kbps Xing/VBRI VBR - MPEG 2.5 Layer 3 standard (8, 11.025 and 12 kHz) 32/40/48/56/64/80/96/112/144/160 Kbps Xing/VBRI VBR Disc Writing Method - Disc at Once and Track at Once - Multi Session If the 1st session is CDDA, you can playback Only CDDA track, If the 1st session is MP3, you can playback only MP3 file. Accessories (1) USB cable (2) RCA cable (3) Auto-Start cable (4) AC cord P70 http //www.voxoa-pro.com/products.php?lang=en kind=11 pid=31#.WG-YBR6UeUk
https://w.atwiki.jp/battlefield1918/pages/281.html
VITRY -ヴィトリー- 目次 ブリーフィング 全体マップ チケット設定 陣地 登場兵器 解説 史実 コメント ブリーフィング In the Marne Valley near the town Vitry sur Seine both sides are facing each other. German troops have occupied a village with an historic church. The french officers instruct their troops to attack and free the village. The flags have to be controlled to end the battle successfully. ヴィトリー・シュル・セーヌの街の近くにあるマルヌ渓谷の両側で両軍は布陣している。ドイツ軍は歴史的な教会がある村を占領している。フランス軍の指揮官達はその村を解放するための攻撃を部隊に命令した。戦いに勝利するためには陣地を占領しなければならない。 全体マップ チケット設定 陣営 比率（COOP） 減少速度（COOP） -% (-%) - (-) -% (-%) - (-) 陣地 陣地名 初期陣営 価値 白旗時間 確保時間 補足 --------------------未編集-------------------- - - - --------------------未編集-------------------- - - - 登場兵器 陸上兵器 --------------------未編集-------------------- --------------------未編集-------------------- 海上兵器 --------------------未編集-------------------- --------------------未編集-------------------- 航空兵器 --------------------未編集-------------------- --------------------未編集-------------------- 固定兵器 --------------------未編集-------------------- --------------------未編集-------------------- その他 --------------------未編集-------------------- --------------------未編集-------------------- 解説 未編集 史実 未編集 コメント コメントは最新20件が表示されます。 （過去のコメントを参照） 名前 コメント すべてのコメントを見る
https://w.atwiki.jp/urinaranida/pages/122.html
「WZ-120-1G FT」 ガルパン：秋山優花里使用 わりとシンプル。ただしラジエーターが発光 PASS nidanida https //ux.getuploader.com/nidanida916/download/81
https://w.atwiki.jp/usbsp/pages/19.html
USBメモリ 47本目より 127 名前：123[sage] 投稿日：2011/03/31(木) 12 27 24.60 ID 3B0XOlfz GH-UFD8GDP 1000MBです。 ----------------------------------------------------------------------- CrystalDiskMark 3.0 (C) 2007-2010 hiyohiyo Crystal Dew World http //crystalmark.info/ ----------------------------------------------------------------------- * MB/s = 1,000,000 byte/s [SATA/300 = 300,000,000 byte/s] Sequential Read 30.856 MB/s Sequential Write 19.080 MB/s Random Read 512KB 30.876 MB/s Random Write 512KB 1.939 MB/s Random Read 4KB (QD=1) 6.321 MB/s [ 1543.3 IOPS] Random Write 4KB (QD=1) 0.018 MB/s [ 4.5 IOPS] Random Read 4KB (QD=32) 6.386 MB/s [ 1559.0 IOPS] Random Write 4KB (QD=32) 0.020 MB/s [ 4.8 IOPS] Test 1000 MB [K 2.6% (196.4/7634.0 MB)] (x5) Date 2011/03/31 9 51 27 OS Windows 7 Ultimate Edition [6.1 Build 7600] (x86)
https://w.atwiki.jp/konaasobi/pages/65.html
ニトログリセリン（NITRO） VIRUS ANT 可燃性・・・有 落下速度・・・WATERとほぼ同じ。 アクション・・・NITROを爆発させ飛ぶ。 爆破速度・・・約150～160dot/フレーム FIREなどの高熱ドットに触れると爆発する。 また、ニトロに対してDRAG操作をする、強い風に吹かれる、 他のドットの爆発に巻き込む、高速で飛翔するSuperBallとぶつかるなど、 ある程度強い衝撃を加えても爆発する。 爆発すると強い爆風とFIREを出す。 PLAYERのアクションでは、ニトロを後ろに吐き出す同時に爆発させ 飛ぶことが出来る。 とはいえ、NITROやFIREで起きる風で飛んでるようなもので 飛ぶ方向はその時の風向きや気圧によって変化する。 このときに出るFIREで自滅する事がよくあるが、コツを掴めばずっと飛んでいられる。それでも、運が悪ければ自滅するが。 ロケットマンだね。 落下しつつのロケット噴射は操作が非常に難しいよね。 -- (パイン) 2010-03-29 10 12 09 実はたまに吹き出る爆発前のニトロを踏んで小ジャンプできるようになってることがあるから それを有効活用すれば楽かも -- (たじまーる) 2011-05-09 18 45 08 爆弾はこれがオススメ -- (にゅー) 2011-07-04 19 06 53 これが一番かな -- (虎) 2011-10-20 16 32 58 DRAGしても爆発した。 -- (Angel（正真正銘）) 2011-12-31 23 28 20 ファイアがたくさんあるから広範囲に 風がでるんだよ。 -- (光次) 2012-02-11 11 39 25 NITORてなってる -- (名無しさん) 2012-06-09 17 12 42 NITORの修理完了 -- (名無しさん) 2012-06-09 17 16 52 衝撃にて爆発する旨を書き足しました。 -- (ましゅ) 2012-08-17 17 48 26 DRAGしても ソ～ッと動かせば爆発しない イライラ棒みたいな使い方もできる？ -- (春鳥) 2012-10-08 16 47 07 １フレームで何ドット爆発が進むのかを書きました -- (ななし) 2014-12-27 20 21 06 残りdot0のときは何も出さずに飛ぶ -- (名無しさん) 2015-04-29 12 04 49 すいません2の話でした -- (名無しさん) 2015-04-29 12 05 47 名前 コメント すべてのコメントを見る
https://w.atwiki.jp/mahoroa/pages/944.html
作る？ Vitriolic a Strokeとは？ これの事である。 作品 バテン・カイトス 終わらない翼と失われた海 概略 カラスが初めて戦うボスとの戦闘BGM。作曲は桜庭統。 関連 新BGM投票 BGMリスト コメント 名前 コメント
https://w.atwiki.jp/zayin/pages/71.html
解散しました 大部分の人間がふわ・ω・もこ、しゃなたん愛し隊、とんデレ行為最低だなに移籍 というわけで暇な奴はこの三つの部隊の項目作成よろしく +過去の情報 総合力 ★★★ 連携力 ★★ 所属人数 ★★★★★ 初心者育成 ★★★ 厨房度 ★ 勝ち馬属性 ★ 問題児 人数１５０人を超えるエル最大の部隊。 だが他者(・ｘ・)の講習会に文句をつける、 ブロックリストに放り込んだまま銀行をするなどの 数々の嫌がらせに耐えかねて続々と部隊がエルを去りつつあるようだ。 (・ｘ・)が勝手に対立しているだけで他部隊とは然程仲は悪くないようだ 人数が多すぎるせいか良識のある人と厨房とのマナーの落差が激しい エルが起こす戦争の大半はニトロかイノによる布告である キャラを複数入れたり、ＩＮ率がかなり低い人もいることから活動人数は多くても70人程度と思われる 12月20日時点での部隊員数が170を突破。上限に達したら新規に部隊を作るとか作らないとか NITROが起こす戦争では大抵上位にNITRO部隊員がいることから質は良いと思われる ニトロの部隊員の降臨(?)により、厨房度★★★くらいはあるのではないかと思われる (1/20)しゃなたん、キユなどの有名な人物がノーブルナイツへ移籍しているのを確認、 現在ほとんどスレの話題にも上がらず部隊員も目立たないので厨房度を★へ格下げ。 ↑レンタル移籍らしい。 恐らくそのうち戻ってくる・・・はず 幽白部隊の登場により、影が薄くなっている ↑しゃなたんニトロに戻ったのを確認（1/27） だが、最近では相次ぐ初心者の流入と中堅層が相次いでNITROを去る、移民する、麻雀部の活動に勤しむ等弱体化が懸念される。 総合力という点では、前線スコア厨の多い幽☆遊☆白書よりは裏方、召喚ができる人材が多く揃っており、Zエルソードの部隊の中では最もバランスの良い部隊である。 498 ：名無しさん＠ｺﾞｰｺﾞｰｺﾞｰｺﾞｰ！ ：2007/11/07(水) 19 08 48 ID EBB7C5ea エルのニトロは結構うまい奴おおいとおもうがな スコアの話じゃ意味ないかもしれんが上位多いし ただ新規も多いみたいだからnoobもたくさんだな 499 ：名無しさん＠ｺﾞｰｺﾞｰｺﾞｰｺﾞｰ！ [sage] ：2007/11/07(水) 19 16 37 ID WbXF1gJO ニトロは絞ってる奴いるからな ハイド暴いてバッシュしたとたん無敵とかやめてください＞＜ 2/20 ニトロの総合力★４ 連携力★３は自演だとしても高すぎなので★－１ 幽白消えて実力が見えた 筆者的に、上手いと思えるのはしゃなたん・ご隠居・かももこ・現神人くらいで、現神人が抜けたのと、しゃなたんなどの主力メンバーを余りみなくなった現在は、戦力が相当落ちたと考えられる ↑無知もいい所だな。しゃなたんとかももこが上手いとかないわ。それと現神人じゃなく現人神だ。名前間違えんなカス。
https://w.atwiki.jp/dustgame2/pages/116.html
概要 ver2.6で追加。ニトロ。 一斉に爆発する爆薬。DRAGによって爆発させることができる。 他、FIREはもちろん、BOMBや高速のS-BALLなどによっても爆発する。 FISHが泳げる粉の一つ。 FUSEが吸収できる粉の一つ。NITROを吸収したFUSEは、FIREを出しながら激しく燃焼する。 コメント欄 名前 コメント すべてのコメントを見る
https://w.atwiki.jp/bemani2sp/pages/3951.html
GENRE TITLE ARTIST bpm notes CLEAR RATE PROGRESSIVE METAL Vitrum BEMANI Sound Team "Yvya" 146 1848 n%（yyyy/mm/dd） 攻略・コメント 全体的に密度は高くないが終盤の二重階段からの皿絡み、縦連、軸を含めたラス殺しがやや強烈。道中も皿絡みや二重階段があるものの速度は遅めなのでゲージ維持、回復はしやすめ。 -- 名無しさん (2020-11-19 16 57 26) 前半は結構リズム難 CNも容赦なく降ってくる 得意な人はかなり好きそうな譜面 -- 名無しさん (2020-11-19 20 47 28) ズレや連打やCNが多くてスコアがやや出にくい印象 -- 名無しさん (2020-11-20 19 19 07) 全体的には乱のがいいと思ったけど序盤の時間差複数ＣＮ複合がイミフになる そこ以外は曲中大半が延々と二重乱打になるので結構楽しい譜面かも -- 名無しさん (2020-11-20 23 06 02) 許容BP多めで60〜70辺りからハード狙える。OPはR乱ならCN地帯をあまり崩さず、かつ二重階段と皿複合も比較的押しやすくなるのでオススメ -- 名無しさん (2020-12-01 12 39 58) 今作の12の中でも地味にEXH苦戦した。CN地帯超えれば勝ちなんだけど、CN地帯が他曲でも中々無い位のキツイ配置に感じた。序盤の同時押し連打地帯も癖がつきやすいので、EXH粘着するよりは動画でCN地帯の指の動かし方を予習してから挑戦してみるのがいいかも。 -- 名無しさん (2020-12-04 20 45 57) 1P正規BP19でエクハ、道中は無難に当たってるけどラス殺しで満タンから10%まで追い込まれてヒヤヒヤした -- 名無しさん (2022-07-02 20 58 59) 1P鏡BP23でEXH。基本的に二重階段は左肩上がりなので、右肩上がりの方がやりやすい人は鏡。CN地帯は36小節あたりが最難かな、そこからは回復したい。上の人と同じく、最後でMAXからジリ貧に追い込まれたので油断大敵。グチャグチャっとしてて捌きにくい。 -- 名無しさん (2022-10-08 19 10 49) 癖強めな低速地力の典型。CN・二重階段・螺旋階段の地力チェックに。 -- 名無しさん (2023-03-07 14 16 07) 名前 コメント